Otázka: Genové inženýrství
Předmět: Biologie
Přidal(a): krojcik
GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ
Příprava umělých kombinací genů a jejich zavádění do genomu organismů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výstavbu.
- Klonování DNA
- Příprava rekombinantních molekul DNA
- Zakládání genových knihoven
- Mutageneze IN VITO
- Příprava transgenních organismů (GMO)
- Genová terapie
- Klonování živočichů
Historie biologických živočichů
- 1933 T.H. Morgan – NC funkce chromozomů při studiu dědičnosti
- 1944 O. Avery, C. Macleod, M. McCarty – DNA určuje dědičné vlastnosti
- 1953 J.D.Watson, F.H. Crick, M.H.F. Wilkins – popsali strukturu DNA, NC v 1962
- 1968 M.W.Nirenbergs a G. Khorama – NC za vyřešení genetického kódu
- 1968 R. Holley – NC za objev struktury tRNA
- 1997– Naklonování ovce Dolly
- 2001– rozluštění 93% lidského genomu, kompletní genom publikován v r. 2003
- Projekt HUGO (human genom organization)
- Člověk má cca 20 – 25 000 genomů – počet zjištěných (předpokládaných je cca 39 000)
- Rozsah lidského genomu je cca 3 X 109 BP
KLONOVÁNÍ DNA
- Je to tvorba klonu DNA (soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA připravených genovým inženýrstvím)
Využití klonované DNA:
- Izolace genů -> studium její struktury a FCE
- Studium regulačních oblastí, které řídí expresy genů
- Fyzikální a genetická analýza genomů
- Exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích a získávání jejich produktů ve velkém množství
Cílem – příprava látek využitelných v průmyslu (enzymy) (zdravotnictví – hormony a vakcíny)
KLONOVÍNÍ DNA PROBÍHÁ VE 3 FÁZÍCH
1. DNA určena ke klonování se restrikčními enzymy = restrikční endonukleázy (stříhající) rozštěpí na kratší úseky = restrikční fragmenty.
- Tyto restrikční fragmenty se musí zabudovat do tzv. vektorové DNA do hostitelských buněk.
- Jako vektorová DNA se používá molekulární DNA z bakterií kvasinkových plazmidů nebo z bakterií rostlinných a živočišných virů.
- Spojování klonované DNA s vektorem DNA umožňuje enzym DNA – ligáza =>vzniká tzv. rekombinantní DNA
2. Přenos rekombinantní molekuly DNA do vhodné hostitelské buňky a její pomnožení.
- Pro klonování DNA (genu) se jako hostitelský organismus používá bakterie E. Coli (eischerischi)
- Přenos plazmidů z rekombinantní DNA do E.Coli se uskutečňuje těmito procesy:
- TRANSFORMACE
- Při ní bakteriální buňky přijímají volnou DNA z okolního prostředí
- ELEKTROPORACE
- Na bakteriální buňky působíme krátkým elektrickým pulzem o vysokém napětí, to udělá v B.S. dírky (póry), jimiž DNA vstoupí do buňky
- BATERIOFÁG (lambda)
- Přenos je zprostředkován přirozenou fágovou infekcí
3. Selekce klonu buněk obsahující požadované molekuly rekombinantní DNA
- Nejdříve si musíme založit tzv. Genovou knihovnu pro daný organismus => soubor klonovaných fragmentů genomové DNA, ty nám reprezentují celý genom daného organismu
- V této genové knihovně se potom klon obsahující urč. gen vyhledává pomocí molekulárních sond:
- sondy pro vyhledávání sekvencí DNA
- sondy pro vyhledávání produktů hledaných genů
TRANSGENNÍ ORGANISMY
- transgen= gen upravený metodami gen. inž. přenesený do nového hostitel. organismu
- transgenní organismu = GMO (genom GMO obsahuje stabilně začleněný transgen)
- transgenoze – postupy, kterými se do organismů vnášejí cizorodé geny z nepříbuzných organismů
- využití:
- zvýšení výnosů a nutričních hodnot plodin (obilniny, kukuřice, rýže), produkci zvířat
- transgenní organismy se vyznačují tím, že mají vlastnosti, které by se volně v přírodě v průběhu evoluce volně nevytvořily
GENETICKY MODIFIKOVANÉ JEDNOBUNĚČNÉ ORGANISMY
- využívány jsou hlavně bakterie a kvasinky. Šlechtěním a metodami gen. inž. byly jejich metabolické dráhy upraveny tak, aby se zlepšily vlastnosti produktu nebo aby se zvýšilo množství
- využívají se hl. v těchto oborech:
- sladovnictví, pekařství, výroba sýrů
- likvidace odpadních látek (čistění odpadních vod, odstraňování radioaktivního odpadu, likvidace pneumatik a ropných havárií)
- chemický průmysl (výroba enzymů, antibiotik, org. kyselin, aminokyselin, vitamínů a alkaloidů)
- lékařství, farmaceutický průmysl (výroba lidského inzulinu a růstových hormonů, očkovací vakcíny proti hepatitidě B)
TRANSGENNÍ ROSTLINY
- pro přenos cizorodých genů do rostlinných buněk používáme následné způsoby:
- pomocí půdních bakterií rodu AGROBACTERIUM
- pomocí vektorů odvozených od rostlinných DNA virů (např: virus zlaté mozaiky rajčete, virus mozaiky květáku)
- biolistická metoda – nastřelování
- lipofekce
- elektroporace
- mikroinekce DNA do buněk
- makroinekce DNA do pletiv
VYUŽITÍ TRANSGENNNÍCH ROSTLIN
- odolnost proti hmyzím škůdcům
- odolnost proti virům
- odolnost proti herbicidům
- navození lepších vlastností plodů a semen (rajčata)
- zdroj nových surovin
- zdroj látek s farmakologickými účinky
TRANSGENNÍ ŽIVOŽICHOVÉ
- metody přenosu modifikovaných genů do živičicha:
- transfekace
- elektroporace
- lipofekce
- fůze eukaryotických buněk s bakteriálními protoplasty, které obsahují cizorodou klonovanou DNA
- mikroinekce
- přenos pomocí virových vektorů
PŘÍPRAVA TRANSGENNÍCH SAVCŮ
- Modelový organismus je myš. Přenos DNA do oplozených vajíček myší.
- Přenos DNA do embryonálních genových kmenových buněk myši
TRANSGENNÍ HOSPODÁŘSKÁ ZVÍŘATA
1. příprava hospodářských zvířat s lepšími užit, vlastnostmi
Můžeme toho docílit:
- změnou metabolických drah
- změnou hormonální rovnováhy
- tvorba zcela nových proteinů
Např:
- prasata s vyšším obsahem tuku v mase
- ovce, jejichž vlna má výhodnější chem. složení
- drůbež, která má vyšší obsah lysozymu v bílku
- ryby, které jsou tolerantní ke změnám obsahu soli ve vodě nebo odolné na znečištění vody
2. Vytváření transgenních zvířat, z jejichž tělních tekutin lze získat farmakologicky významné látky
Např:
- transgenní ovce, jejichž mléko obsahuje vysoké procento látek pro léčbu hemofilie
GENOVÁ TERAPIE
- V buňkách pacientů –oprava gen. poruch genetické informace nahrazením defektních genů funkčními alelami
- GENOVÉ TERAPIE IN VITRO
- GENOVÉ TERAPIE IN VIVO
1. GENOVÁ TERAPIE IN VITRO
- Do buněk odebraných z těla pacienta se vnesou geny. Ty buňky, ve kterých došlo k expresi daného genu se pomnoží a vrátí se zpět do pacienta, kde zajistí normální FCI
Principy gen. terapie:
- zvýšení počtu kopií genů
- cílené usmrcení specifických buněk
- cílená oprava mutace
- cílené potlačení gen. exprese
2. GENOVÁ TERAPIE IN VIVO
- Při tomto způsobu se geny přenášejí pomocí vhodného vektoru do buněk nacházejících se v těle pacienta.
- U člověka je povolené z etických důvodů upravovat gen. defekty pouze v somatických tělních buňkách (NE V ZÁRODEČNÝCH BUŇKÁCH !!!), protože by se upravená gen. informace přenášela na potomstvo a pak v dalších generacích by mohla uškodit
Metody gen. terapie pro léčbu molekulárních gen. poruch:
- Zvýšení počtu kopií genů
- vnesení několika kopií standartního genu do defektních buněk zvýší hladinu jeho produktů na úroveň, která zajistí normální fenotyp organismu
- Vhodný způsob v autozomálně recesivních dědičných chorob vzniklých mutací
- Cílené usmrcení specifických buněk
- gen vnesený do cílových buněk vytváří toxický produkt, který tyto buňky usmrtí
- vhodný způsob při léčbě rakovin a nádorů
- Cílená oprava mutace
- výměna mutačních alel za alely standartní homologickou rekombinací
- Cílové potlačení gen. exprese
- a) exprese genu je zastavena na úrovni DNA => zablokování replikace
- b) na úrovni RNA => inaktivace m- RNA
- c) na úrovni proteinu – specifické intracelulární protilátky se navážou na tyto defektní proteiny a inaktivují je
LÉČBA NĚKTERÝCH DĚDIČNÝCH ONEMOCNĚNÍ
- vrozené vady metabolismu (hemofilie, cystická fibróza)
KLONOVÁNÍ ŽIVOČICHŮ
- Vytvoření identických kopií buněk nebo organismů nepohlav. cestou
- KLON = soubor identických buněk nebo organismů odvozených od společného předka nepohlavní cestou (mitóza – eukaryota, dělení – prokaryota)
Genetika člověka
- šimpanz s člověkem se liší pouze v 1,5% nukleotidů
- 96% sekvencí máme stejných
- podle nejnovějších průzkumů máme 23 000 genů (26 500), (předpoklad 40 000)
- máme jen o 1000 genů více než háďátko
- většina DNA nemá genovou FCI, nedeterminuje
- chromozom nese nejvíce genů – 23 genů, nejméně nese chromozom Y – 5 genů
- genetika člověka se řídí obecně platnými zákonitostmi, ale má odlišné metody výzkumu – etika => člověk nesmí být využíván ke gen. pokusům
